La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en Inglés) es una técnica indispensable en biología molecular. Fue desarrollada en 1984 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis. A día de hoy, es raro encontrar un laboratorio de biología molecular que no tenga una máquina para realizar PCRs conocida como termociclador. La PCR permite una rápida amplificación de incluso la más pequeña cantidad de material genético (ADN o ARN) en distintos tipos de muestras. Es por tanto usada en distintos contextos biológicos, desde genética humana y biología vegetal, hasta microbiología o incluso técnicas forenses.
La reaccion en cadena de la polimerasa y sus componentes
La técnica PCR se basa en un ciclo de tres pasos que se repiten continuadamente durante un periodo de tiempo concreto. Dependiendo de la muestra, en ocasiones se requerirá un previo proceso de lisis (ruptura de las células para exponer su material genético). Una vez que el material genético esta libre y se ha eliminado todo el contenido celular indeseado (como pared celular, membranas o proteínas restantes) la muestra se puede utilizar para la PCR.
primers = cebadores
DNTP MIX = NUCLEÓTIDOS
TAQ DNA POLYMERASE = ENZIMA TAC POLIMERASA
PCR GRADE WATER = AGUA DE CALIDAD PCR
Básicamente, con la PCR, alguien puede identificar la presencia de una secuencia genética y amplificarla. Para ello, una secuencia específica de un gen u organismo debe ser elegida. En la muestra (normalmente procedente de humanos, animales, plantas o cultivos bacterianos) también puede haber material genético de otros organismos, lo que se conoce como contaminación. Sin embargo, si el segmento de material genético elegido para amplificar es específico, debería ser posible una detección precisa.
El primer paso consiste en la separación de las dos hebras de DNA, o desnaturalización. Se puede conseguir simplemente sometiendo el material genético a una temperatura elevada (94 – 96ºC) que “funde” los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras y hace que se separen.
El segundo paso en el ciclo consiste en bajar la temperatura a 55-68ºC. Esto permite que los cebadores u oligos se unan a la hebra molde del material genético, (Garibyan & Avashia, 2013). Estos oligos son secuencias sintéticas de unos pocos nucleótidos complementarias a los extremos del fragmento que deseamos amplificar.
Una enzima llamada DNA polimerasa puede adherirse a la zona donde el cebador se ha unido. En el tercer paso del ciclo, la temperatura se eleva a 72ºC y esto permite a la polimerasa elongar la hebra complementaria al DNA molde. Esto significa que la polimerasa viaja desde el extremo denominado 3´al extremo denominado 5´de la hebra molde, catalizando la unión de nuevos nucleótidos (que previamente hemos debido añadir al tubo de reacción). En concreto, para la reacción se usa la enzima Taq polimerasa, que proviene de la bacteria Thermus aquaticus. Este organismo sobrevive en ambientes de elevada temperatura y por tanto posee una polimerasa adecuada para soportar estos cambios dramáticos de temperatura.
Al final de la reacción, la hebra única de ADN inicial se habrá convertido en una doble hebra. Entonces, repetiremos el ciclo de nuevo: elevaremos la temperatura y esta doble hebra se separará en dos hebras únicas que servirán de molde para generar dos nuevas dobles hebras en el siguiente ciclo. Este proceso continuará por un determinado número de ciclos y así obtendremos una gran cantidad de copias del gen o fragmento de ADN de interés.
El termino de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) se refiere por tanto al uso de la polimerasa de manera sucesiva. En cada ciclo, las hebras presentes se duplican, consiguiendo una amplificación exponencial de modo que con una sola hebra inicial podamos obtener suficientes copias para el prosiguiente análisis. Las moléculas (copias de la secuencia de interés) resultantes de la reacción se denominan amplicones.
RT-PCR
La técnica PCR tradicional como se ha descrito arriba solamente es posible si partimos de una doble hebra de material genético (ADN). Sin embargo, el RNA solamente cuenta con una hebra, ¿cómo podemos amplificarlo? Requeriremos de una enzima adicional denominada “transcriptasa reversa” que se añade a la mezcla de PCR. Esta enzima primero lee el RNA y crea una hebra complementaria de ADN (conocida como cDNA). Ahora ya tenemos una doble hebra que podemos amplificar como se ha descrito anteriormente para la doble hebra de ADN.
qPCR
La PCR cuantitativa (qPCR) o PCR a tiempo real puede utilizarse para cuantificar la cantidad inicial de material genético presente en una muestra. Esto se puede conseguir de dos formas, de manera específica o inespecífica. En el primer caso, un colorante inespecifico de material genético (ejemplo “SYBR green”) se puede añadir a la mezcla. A medida qeu el ADN se multiplica en la reacción, el colorante se intercala en el producto y solo entonces será fluorescente. Como consecuencia, la cantidad de fluorescencia es un reflejo de la cantidad de total de ADN producida. Para la cuantificación específica se usará lo que se denomina sonda (pequeño fragmento de material genético) que contiene una etiqueta fluorescente (fluoróforo) así como un inhibidor (quencher) de dicha fluoresncencia. La sonda se une al ADN que se va a copiar, y cuando la polimerasa lo amplifica desplaza el inhibidor de modo que el fluoróforo puede emitir fluorescencia al excitado con la luz adecuada [referencia]. La señal que obtengamos será, por tanto, representativa de la cantidad de amplicones que tenemos.
Diagnóstico por PCR
La PCR permite detectar y amplificar la presencia de un determinado material genético. Como consecuencia esta técnica tan versátil y y automatizada es muy útil en el ámbito clínico. Por ejemplo puede usarse para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Los patógenos (bacterias, virus y parásitos) que las causan contienen ADN o ARN. Para detectar un nuevo patógeno, los investigadores simplemente tienen que encontrar una secuencia de material genético que sea especifica de este patógeno y hacer los cebadores correspondientes para su amplificación (Zauli, 2019). Si se produce amplificación, podremos confirmar la presencia del material genético y por tanto del patógeno.
Algunos patógenos se “cobijan” dentro de las células humanas y por tanto no pueden detectarse con otras técnicas como la microscopía. Este es el caso de la malaria, por ejemplo. Otra técnica de diagnóstico es la “serología”, que detecta la presencia de anticuerpos generados por el sistema inmune ante la presencia del patógeno, en lugar de detectar el patógeno como tal. Sin embargo, estos anticuerpos producidos para defender nuestro organismo pueden tardar varios días o semanas en producirse.
En el ambiente hospitalario es por tanto preferible tomar una muestra de los pacientes y realizar un test PCR usando cebadores específicos para amplificar el material genético de un patógeno, como la Malaria, los virus SARS, o el virus del Ébola. En el caso de la pandemia actual, se toman muestras nasofaríngeas de pacientes sospechosos que se analizan en cientos o miles de laboratorios alrededor del mundo. La precisión y versatilidad de la PCR hacen que sea una técnica clave e indispensable en el ámbito clínico.
Referencias:
Garibyan, L., & Avashia, N. (2013). Polymerase chain reaction. The Journal of investigative dermatology, 133(3), 1–4. https://doi.org/10.1038/jid.2013.1
http://www.karymullis.com/pdf/pr-1993.pdf
https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
https://en.wikipedia.org/wiki/TaqMan
Zauli, D. A. G. (2019). PCR and Infectious Diseases. In Perspectives on Polymerase Chain Reaction. IntechOpen.
Sobre Violette del equipo iGEM Leiden 2020
Mi nombre es Violette y soy parte del equipo iGEM Leiden 2020, Rapidemic, en el que tratamos de desarrollar un test diagnóstico rápido para enfermedades infecciosas, usando un método de detección de ácidos nucleicos. También soy estudiante de primer año del master de ciencias biomédicas. Siempre me ha interesado la biología y la bioquímica, así como la biología molecular. Por consiguiente, ¡el tema de la PCR encaja tanto con mis intereses personles como con el proyecto que nuestro equipo iGEM está desarrollando!