Polymeraskedjereaktionen är en central teknik inom molekylärbiologi. Tekniken utvecklades 1984 av den amerikanska biokemisten Kary Mullis. Numera är det osannolikt att du någonsin kommer att sätta foten i ett molekylärbiologilaboratorium som inte har en PCR-maskin, även kallad termocykler. PCR möjliggör mycket snabb multiplikation även av de minsta mängderna genetiskt material: DNA eller RNA, från en mängd olika provtyper. Det används därför i en flera olika miljöer och områden av biologi, från mänsklig genetik och växtbiologi, till mikrobiologi eller till och med kriminalteknik.
Polymeraskedjereaktionen och dess komponenter
PCR-tekniken bygger på en cykel i tre steg som upprepas kontinuerligt under en definierad tid. Beroende på typ av prov kan vissa behöva genomgå ett lyssteg (bryta upp cellerna för att exponera det genetiska materialet), till exempel för humana eller bakteriella celler, virus eller parasiter. Detta gör det möjligt för nukleinsyror att frigöra sig från alla associerade proteiner. När nukleinsyrorna och cellresterna är fria (såsom cellvägg eller membran, kärnor eller återstående proteiner) och har avlägsnats kan provet användas för PCR.
I huvudsak kan man med hjälp av PCR identifiera närvaron av en specifik genetisk sekvens och förstärka den. För att göra detta bör en sekvens som är specifik för en viss gen eller en organism väljas. Eftersom denna teknik ofta används på prover från människor, djur, växter eller bakteriekulturer kan genetiskt material från många andra organismer eller kontaminering vara närvarande. Men om den valda regionen är specifik i en enda organism kommer exakt detektering att vara möjlig oavsett vilket annat material som finns.
Det första steget innebär att DNA-strängarna dras isär eller denatureras. Detta görs helt enkelt genom att utsätta det genetiska materialet för en temperatur av cirka 94°C till 96°C. Vid denna temperatur “smälter” vätebindningarna mellan molekylerna och de separeras.
Värmecyklern sänker sedan temperaturen till ungefär 55-68°C. Det är här primers kan binda mallsträngen, även kallad ”annealing” (Garibyan & Avashia, 2013). Primers är korta syntetiska sekvenser av några nukleotidbaspar (korta genetiska sekvenser) som är komplementära till genen av intresse, se Figur 3.
Ett enzym som kallas DNA-polymeras kan sedan fästa sig vid den del där primern är bunden. När temperaturen höjs till omkring 72°C igen förlänger polymeraset den komplementära strängen. Detta innebär att polymeraset rör sig från 3 ’till 5′-änden av mallsträngen, vilket katalyserar fästningen av nya nukleotider (närvarande i reaktionsröret) till strängen på väg. Enzymet som används för denna reaktion kallas ett Taq-polymeras, som kommer ifrån Thermus aquaticus-bakterierna. Denna organism trivs i miljöer med mycket hög temperatur och har därför ett polymeras som är lämpligt för att motstå dessa drastiska temperaturförändringar.
I slutet av den långsträckta strängen “faller” enzymet av. Som en konsekvens blir den initiala enkelsträngen DNA nu en dubbelsträngad DNA-del. Efter det sista steget höjs temperaturen igen för att denaturera trådarna, vilket initierar en ny cykel i förstärkningen. Denna process fortsätter och resulterar i många kopior av genen av intresse.
Uttrycket polymeraskedjereaktion (PCR) hänför sig således till användningen av ett polymeras i en successiv reaktion. För varje cykel amplifieras föreliggande strängar exponentiellt, så att efter ett par cykler amplifieras en enda tråd till en mängd som är tillräcklig för att användas för ytterligare analys. De resulterande molekylerna efter reaktionen kallas amplikon.
RT-PCR
Den traditionella PCR-tekniken som beskrivs ovan är endast möjlig när man börjar med en dubbelsträngad bit genetiskt material (DNA). När det gäller RNA paras inte trådarna eftersom de är enkelsträngade. Som ett resultat kan ett ytterligare enzym som kallas ”omvänt transkriptas” läggas till i PCR-blandningen. Detta enzym läser först RNA för att skapa en komplementär DNA (cDNA) -sträng, som är en DNA-sträng som görs baserat på en mRNA-mall. Resten av reaktionen liknar den för PCR som använder DNA.
qPCR
Kvantitativ PCR (qPCR) eller realtids PCR (inte att förväxla med omvänd transkription, RT-PCR!) Kan också göras i laboratoriet för att kvantifiera den ursprungliga mängden genetiskt material som finns i ett prov. Detta kan uppnås på två sätt, specifikt eller ospecifikt. I det första scenariot kan ett icke-specifikt färgämne (som SYBR green) läggas till i blandningen. När DNA-strängarna förökas interkalerar det fluorescerande färgämnet i produkten. Som en konsekvens återspeglar mängden fluorescens den totala mängden producerat DNA. För specifik kvantifiering används en sondbaserad realtids-PCR. För att göra detta kan en sond (liten bit genetiskt material), innehållande ett fluorescerande märke och en släckare, läggas till i PCR-röret. En släckare är avsedd att förhindra att någon fluorescens släpps ut så länge den fluorescerande etiketten är i närheten. Sonderna binder till den del av DNA som ska kopieras. När polymeraset kopierar DNA: n förskjuts sonden med fluorescerande märkning (fluorofor) och frigör den från släckaren [source]. Dessa fluoroforer ackumuleras i reaktionsröret och avger en signal som är representativ för mängden amplikon när de är upphetsade med ljus. Den exakta koncentrationen av initial nukleinsyra av intresse närvarande i röret kan således bestämmas utifrån fluorescensen.
PCR vid diagnos
PCR kan användas för att detektera närvaron av en gen eller för att amplifiera det genetiska materialet för vidare användning. Till följd av detta uppskattas denna mycket mångsidiga och till stor del automatiserade teknik i kliniska miljöer och bortom. PCR används till exempel för diagnos av många infektionssjukdomar. Patogener, bakterier, virus och parasiter innehåller DNA eller RNA. För att upptäcka en ny patogen behöver forskare bara hitta en kort sekvens som är specifik för denna patogen och göra motsvarande primers (Zauli, 2019).
Vissa patogener kan “gömma sig” inuti celler och kan därför inte alltid detekteras med tekniker som mikroskopi. Detta kan till exempel vara fallet för Malaria. Dessutom upptäcker en annan diagnostisk teknik som kallas “serologi” kroppens reaktion på närvaron av patogenen (antikroppar), snarare än att detektera patogenens genom direkt. Dessa antikroppar som produceras för att försvara organismen kan dock ibland ta några dagar eller veckor att utvecklas.
På sjukhus föredras det därför att ta en patients prov och köra ett PCR-test med primers som är specifika för en viss sjukdom, såsom malaria, SARS-virus eller ebola. När det gäller den nuvarande pandemin tas näspinnor från misstänkta patienter och drivs av hundratals eller tusentals laboratorier över hela världen. PCR-teknikens noggrannhet och mångsidighet har gjort metoden till en oumbärlig ”gyllene standard” i medicinska miljöer.
Referenser:
Garibyan, L., & Avashia, N. (2013). Polymerase chain reaction. The Journal of investigative dermatology, 133(3), 1–4. https://doi.org/10.1038/jid.2013.1
http://www.karymullis.com/pdf/pr-1993.pdf
https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
https://en.wikipedia.org/wiki/TaqMan
Zauli, D. A. G. (2019). PCR and Infectious Diseases. In Perspectives on Polymerase Chain Reaction. IntechOpen.
Om Violette från iGEM Leiden 2020
Jag heter Violette och är en del av iGEM Leiden 2020-teamet, Rapidemic, för vilket vi försöker utveckla ett snabbt diagnostiskt test för infektionssjukdomar med hjälp av en nukleinsyradetektionsmetod. Jag är också första året masterstudent i biomedicinsk vetenskap. Jag har alltid varit intresserad av biologi och biokemi samt molekylärbiologi. Därför ligger ämnet PCR nära både mitt personliga intresse och naturligtvis det projekt som vårt team vid Leiden University arbetar med!
